Alessio Loroso Stefano Cabaye, Federica Lui, Luigia Pena, Angelo Royo, Giantonella Poggioni, Annalisa Guercio, Giuseppe Borbari, Domenico Vicari, Sofian Sghir, Stefan Zentara, Massimo Spedicato, Salah Hammami, Thamer Ben Hussein, Ottavio Puranteri, Massimo Ancora, Daria Di Sabatino e Daniela Morelli, Paolo Calistri e Giovanni Savini

L’Organizzazione mondiale per la salute animale (WOAH) elenca la malattia emorragica epidemica (EHD) come una malattia dei ruminanti selvatici e domestici causata dal Virus EHD (EHDV). Ehdv è associato al virus della lingua blu (BTV), l’agente eziologico della lingua blu, una malattia dei ruminanti. Entrambi i virus appartengono al genere Orbivirus e circolato in più sierotipi (1E2). I loro genomi virali sono costituiti da 10 segmenti (S1-S10) di RNA a doppio filamento. La proteina strutturale del capside esterno (codificata da S2) determina la specificità del sierotipo. Entrambi i virus causano sintomi clinici simili e sono trasmessi dai bovini colicoidi spp. I moscerini mordono. La lingua blu colpisce principalmente gli ovini e negli ultimi decenni è stata descritta più volte nell’Unione Europea (UE), con conseguenze devastanti per il commercio di animali (3). La maggior parte dei focolai di febbre catarrale in Europa erano di origine diretta in Nord Africa a causa della diffusione di moscerini infetti da BTV da questa regione (1E4–7). Descriviamo il rilevamento di EHDV sierotipo 8 (EHDV-8) nei bovini in Italia, come follow-up dei nostri precedenti studi su EHDV-8 (GenBank access n. OP381190-9) in Tunisia nel 2021 (8).

Il 25 ottobre 2022, sono stati segnalati distress respiratorio, erosioni dell’orofaringe e della mucosa orale e salivazione in 3 bovini dell’Azienda Agricola 1, situata vicino alla città di Trapani, in Sicilia (Fig.); Sono stati raccolti campioni di sangue e sangue intero. Il 28 ottobre 2022 sono stati segnalati segni clinici costituiti da anoressia, cianosi, edema della lingua, congiuntivite e febbre in un animale dell’allevamento 2, situato nel comune di Arbus in Sardegna (Fig.). Il 3 novembre questo animale è morto; La milza è stata raccolta all’autopsia, insieme al sangue intero di altri 3 allevamenti sintomatici dell’allevamento. Il 4 novembre, presso l’allevamento 3 (comune di Arbus) e l’allevamento 4 (confinante comune di Gospini), 3 bovini presentavano segni simili e sono stati prelevati campioni di sangue intero e siero (Fig.). .

Abbiamo testato un campione di sangue di EDTA per animale e un campione di milza per l’RNA EHDV utilizzando un kit VetMAX EHDV (Thermo Fisher Scientific, Inc.). https://www.thermofisher.com). Abbiamo sviluppato la PCR in tempo reale di trascrizione inversa specifica per S2 (rRT-PCR) di un ceppo EHDV-8 rilevato in Tunisia nel 2021 (EHDV-8 TUN 2021) perché il test disponibile è progettato per la diapositiva S2 del riferimento EHDV-8 sierotipo (isolato in Australia nel 1982 (non rilevato EHDV-8 TUN 2021)8). Le sequenze nucleotidiche primarie erano EHDV_Ser8varNEW_fwd AGAGATGAAAGATCGCGAGGA e EHDV_Ser8varNEW_rev GAATCACACGCGCTCACTAA; La sequenza nucleotidica della sonda era EHDV_Ser8varNEW_Probe FAM-ACGGATGAGATACGGAACATACGGGG-TAMRA. Abbiamo preparato il master mix utilizzando TaqMan Fast Virus 1-Step (Thermo Fisher Scientific) e una concentrazione finale di 400 nmol (primer) e 200 nmol (sonda). Dopo aver eseguito la denaturazione dell’RNA a 95 °C per 3 minuti, abbiamo aggiunto 5 μL di RNA a 20 μL della miscela e ottenuto l’amplificazione come segue: 45 °C per 10 minuti, 95 °C per 10 minuti, quindi 40 cicli da 95 °C per 15 secondi e infine 60°C per 1 minuto. Abbiamo eseguito il sequenziamento dell’intero genoma (WGS) (9) su campioni selezionati. Abbiamo testato i campioni di siero raccolti da tutti gli animali con un test ELISA competitivo per l’identificazione di EHDV (Innovative Diagnostics, https://www.innovative-diagnostics.com) e neutralizzando i virus (10). Abbiamo tentato di isolare il virus utilizzando campioni di sangue positivi alla rRT-PCR su cellule Vero (8).

Tutti gli animali prelevati dalla Sardegna e dalla Sicilia erano positivi per EHDV RNA (soglia del ciclo 23-28). La genotipizzazione ha confermato la presenza di ceppi simili a EHDV-8 TUN 2021. Abbiamo segnalato il focolaio al Ministero della Salute italiano, che ha notificato WOAH e alla Commissione Europea, che ha imposto restrizioni al movimento degli animali entro un raggio di 150 km dal focolaio siti. Abbiamo selezionato un campione di sangue EHDV-8 positivo dalla Sardegna per WGS. I risultati hanno confermato che il ceppo Sardinia EHDV-8 (accesso GenBank n. OP897265–74) condivide un’elevata identità di sequenza nucleotidica (> 99,9%) con più ceppi simili a EHDV-8 TUN 2021. Il WGS dei ceppi siciliani è in corso. Abbiamo isolato il virus da tutti i campioni di sangue positivi alla rRT-PCR. Tutti i campioni di siero sono risultati positivi all’ELISA e alla neutralizzazione del virus (titolo anticorpale 10-20).

Conferma del romanzo Orbivirus spp. Era prevista un’incursione nell’Unione europea da parte dell’EHDV-8, data la prevalenza di questo virus in Tunisia e probabilmente nei paesi limitrofi (8). Il 18 novembre 2022, EHD è stata segnalata anche nella regione spagnola dell’Andalusia, nelle città di Cadice e Siviglia. È difficile prevedere scenari futuri per il sistema di produzione zootecnica dell’UE, ma è probabile che l’EHD ponga nuove sfide alle autorità veterinarie dell’UE. Le lezioni apprese dalla lingua blu dovrebbero essere un riferimento per la scelta di strategie di controllo e prevenzione appropriate per l’EHD. Nel complesso, questi eventi sottolineano l’importanza per i paesi europei di avere una forte collaborazione con le autorità del Nord Africa nel campo della salute pubblica e della salute animale. Il rilevamento immediato di EHDV-8 in Sardegna e Sicilia è l’ultimo esempio dei benefici che tali relazioni possono portare. Questa collaborazione si è rivelata decisiva; Ha portato allo sviluppo di un test molecolare specifico e accurato per il rilevamento di EHDV-8, dato che la conoscenza della costellazione del genoma e della relazione genetica di EHDV-8 con i sierotipi presenti in EHDV è già stata raggiunta. Lo sviluppo del vaccino deve essere rafforzato perché la vaccinazione è l’unica strategia per ridurre la circolazione del virus e prevenire perdite economiche dirette e indirette.

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